Extraction ADN

L’analyse d’ADN est un outil puissant pour comprendre les processus biologiques. La plupart des techniques d’analyse d’ADN commencent par l’extraction de l’ADN. Dans ce processus, l’ADN est libéré d’un échantillon et purifié. L’étape de libération consiste à casser les membranes cellulaires pour exposer l’ADN. Les tissus mous tels que le cerveau, le foie et le pancréas sont relativement faciles à homogénéiser.

Cependant, les tissus durs (p. ex. les tumeurs), les tissus élastiques (p. ex. l’intestin et la peau) et les échantillons environnementaux (p. ex. le sol) sont contraignants pour la préparation d’échantillons pour l’extraction de l’ADN. Ces types d’échantillons possèdent des propriétés mécaniques et structurelles qui rendent les procédures d’homogénéisation difficiles à standardiser. En outre, la plupart des matériaux biologiques complexes contiennent des inhibiteurs de PCR et des enzymes qui peuvent dégrader les acides nucléiques présents dans l’échantillon. Une homogénéisation complète doit être réalisée pour obtenir un rendement d’ADN élevé tout en conservant l’intégrité des acides nucléiques. Pour la plupart des applications, il est important de concevoir un protocole reproductible à haut débit pour l’étape d’homogénéisation.

La lyse mécanique, et plus particulièrement la technologie de bead-beating suivie (ou non) par une digestion par des proteases (protéinase K, lysozyme) a été largement reconnue comme la méthode de référence pour les protocoles d’homogénéisation des échantillons et d’extraction de l’ADN. Pour cette raison, Bertin Technologies a choisi la technologie bead-beating en 3D pour développer sa large gamme d’homogénéisateurs, les homogénéisateurs Precellys.

Ci-dessous, nos scientifiques ont partagé leurs conseils de bonnes pratiques pour l’homogénéisation par bead-beating afin de maximiser la qualité de l’ADN obtenu.

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Conseils pour une extraction d’ADN réussie

Les biologistes travaillent sur une variété d’échantillons allant des bactéries aux tissus animaux et aux tissus végétaux. Ces échantillons varient considérablement dans leurs structures physiques et leurs compositions. Il existe sur le marché une grande variété de kits de purification d’ADN conçus pour traiter ces différents types d’échantillons. Bien que ces kits varient, la plupart d’entre eux nécessitent une étape d’homogénéisation avant que l’ADN puisse être extrait. Nos homogénéisateurs Precellys sont compatibles avec une grande variété de kits, y compris ceux qui utilisent un tampon de lyse et des tubes de 2 ml remplis de billes.

Il a été démontré que l’homogénéisation par bead-beating améliore le rendement du processus d’extraction d’ADN, comme le montre la figure 1.

A- Comparaison de la concentration d’ADN extrait de tissus fœtaux et néonatals avec la méthode Precellys et avec la méthode basée sur le traitement par incubation dans une solution de Proteinase K	B- Comparaison de l’ADN extrait de la chlorella sorkiniana (algues) avec la méthode Precellys et avec la méthode basée sur le traitement thermique à la protéinase K
(Données du West Midlands Regional Genetics Laboratory, UK)	(Données de Promega)

Figure 1: Comparaison des méthodologies de lyse enzymatique avec homogénéisation par bead-beating Precellys.

Si votre kit d’extraction d’ADN ne propose pas déjà une étape de lyse par bead-beating, consultez notre page Choisir votre kit de lyse pour trouver une référence adaptée à l’échantillon sur lequel vous travaillez.

Une fois qu’un kit de lyse par bead-beating adéquat a été choisi, l’étape suivante consiste à choisir les meilleurs paramètres pour une homogénéisation efficace.

Lorsque vous travaillez avec de petites billes, il est important de bien choisir la vitesse et la durée du cycle d’homogénéisation ; ces paramètres affectent la taille des fragments d’ADN obtenus comme le montre la figure 2. Ceci est particulièrement important lors de l’homogénéisation des bactéries. La paroi bactérienne est difficile à homogénéiser et de petites billes de verre sont généralement requises pour obtenir une homogénéisation efficace. Nous conseillons de toujours commencer par des cycles d’homogénéisation inférieurs à 30 secondes et à vitesse modérée (soit 4 200 rpm pour Precellys 24 et 6 000 rpm pour Precellys Evolution).

Figure 2: Effet de l’augmentation de la vitesse d’homogénéisation sur la qualité des extractions d’ADN à l’aide de la technologie d’homogénéisation par battement de billes Precellys.

L’homogénat obtenu contient parfois des contaminants tels que des protéines, des polysaccharides et des polyphénols. La digestion de l’échantillon avec de la Protéinase K (cellules, tissus animaux) ou du Lysozyme (bactéries) est une méthode efficace pour éliminer les protéines contaminantes. L’utilisation d’un tampon CTAB (contenant du bromure de cétrimonium) facilite la séparation des polysaccharides pour les échantillons végétaux.

Si vous avez d’autres questions, contactez nos ingénieurs d’application qui se feront un plaisir de vous recommander les meilleurs protocoles pour vos échantillons. Notre base de données complète de protocoles se trouve dans notre Application center.