Technique du Western Blot

La technique du Western Blot est l’une des techniques les plus utilisées pour la détection et la séparation des protéines. Elle repose sur le principe de l’immunochromatographie, un test au cours duquel les protéines sont séparées dans un gel de polyacrylamide en fonction de leur poids moléculaire. Une fois séparées, les protéines sont électro-transférées sur une membrane, puis détectées à l’aide d’anticorps.

La première étape de la technique du Western Blot consiste à préparer le lysat d’échantillon. On utilise souvent un tampon RIPA combiné à un cocktail d’inhibiteurs deprotéases comme tampon de référence, pour obtenir un rendement protéique maximal. La préparation des échantillons constitue la première étape de la plupart des protocoles de Western Blot, y compris l’homogénéisation dans le cas d’échantillons de tissu. Il est essentiel de choisir les paramètres d’homogénéisation avec soin pour obtenir une récupération maximale des protéines et un homogénat de haute qualité, adapté à la technique du Western Blot.

Bertin Technologies propose une solution complète pour les processus de réalisation de Western Blot, constituée des homogénéisateurs Precellys – une gamme d’homogénéisateurs à haut débit qui permet d’obtenir des homogénats tissulaires et des lysats cellulaires de haute qualité – et des anticorps Bertin Bioreagent.

Sur cette page, nos experts ont compilé leurs conseils pour réussir l’homogénéisation de vos échantillons préalablement à un Western Blot. Nous indiquons également quelques-uns de nos meilleurs protocoles de Western Blot à appliquer avec les homogénéisateurs Precellys et les anticorps Bertin Bioreagent.

Conseils et astuces

La réussite d’un Western Blot dépend grandement de l’optimisation de l’étape d’extraction des protéines. Découvrez sur cette page les conseils de nos experts concernant les protocoles de préparation d’échantillons applicables à l’extraction des protéines.

Dans le cas du Western Blot, le rapport tissu/tampon est très important pour obtenir des résultats fiables. Pour les tissus mous comme le foie et le cerveau, le ratio optimal se situe entre 80 et 100 mg de tissu pour 700 μl à 1 ml de tampon. Pour les tissus plus durs et plus élastiques comme le côlon ou le tissu musculaire, il est préférable de respecter un ratio de 30 à 50 mg de tissu pour 500 μl de tampon. Enfin, pour les tissus durs (os, cartilage), un ratio de 50 à 100 mg de tissu pour 700 μl de tampon est un bon point de départ. En outre, les tissus plus durs et plus élastiques ne doivent pas être traités tels quels : il est préférable de les débiter en plus petits morceaux de 50 mg chacun à l’aide d’un scalpel.

S’agissant des protocoles d’homogénéisation, les protéines étant des molécules thermosensibles, il est important d’éviter de surchauffer l’échantillon, et de prévoir des pauses sur de la glace entre chaque cycle d’homogénéisation. Nous vous recommandons vivement de travailler avec le module de refroidissement Cryolys Evolution, qui est capable de maintenir les échantillons à +4 °C pendant toute la durée du processus d’homogénéisation.